一、概述
 

　　共聚焦顯微鏡不同于普通熒光顯微鏡，它利用針孔的物理限制，僅允許來自焦平面的光聚焦進入探測器，而將焦平面上方和下方的模糊熒光信號(離焦光)阻擋在外。這帶來了顯著的優勢：
 

　　??光學切片能力：?? 獲得樣品內部特定深度、薄層(通常在0.5 - 2微米)的高分辨率圖像。
 

　　??更高的分辨率：?? 主要是在軸向(Z方向，沿光軸方向)分辨率顯著提高。
 

　　??背景抑制：?? 大幅減少來自非焦平面的背景噪音，提升圖像的對比度和清晰度。
 

　　??三維重建：?? 通過對樣品不同深度進行連續掃描，可重建三維結構。
 

　　??點掃描成像：?? 圖像是通過逐點掃描激光束并逐點采集信號形成的，速度通常比寬場熒光顯微鏡慢。
 

　　二、關鍵組件
 

　　1.激光光源： 提供高強度、單色性好、方向性好的激發光。通常配備多個不同波長的激光器，用于激發不同的熒光染料。
 

　　2.掃描裝置：
 

　　掃描振鏡： 核心部件，通常是兩個高速振動的反射鏡(X軸和Y軸)，精確控制激光束在樣本表面的掃描路徑。
 

　　掃描透鏡與管透鏡： 確保掃描光束精確聚焦在物鏡的后焦面，實現無畸變掃描。
 

　　3.分光鏡/二向色鏡： 將激發光反射到樣本方向，同時允許樣本發射的熒光透射到探測光路。需要根據所用熒光染料的激發和發射光譜選擇合適的鏡片。
 

　　4.物鏡： 高質量、高數值孔徑(NA)的物鏡至關重要，它決定了系統的分辨率、光收集效率和成像深度。
 

　　5.共軛針孔：
 

　　照明針孔： 位于光源后，將激光變成點光源。
 

　　探測針孔： 位于探測器前，阻擋離焦光。針孔大小可調，是控制光學切片厚度和圖像信噪比的關鍵參數(小針孔切片薄、分辨率高但信號弱；大針孔切片厚、信號強但分辨率降低)。
 

　　6.探測器： 通常是高靈敏度的光電倍增管或雪崩光電二極管，將微弱的光信號轉換為電信號。
 

　　7.計算機控制系統： 控制掃描、Z軸移動、激光強度、針孔大小、探測器增益、圖像采集和處理等所有參數。
 

　　8.熒光濾光片組： 位于探測光路中，進一步阻擋殘留的激發光和其他波長的雜散光，確保探測到的是特定發射波長的純凈熒光信號(發射濾光片)。
 

　　三、主要優勢
 

　　1.高軸向分辨率(Z分辨率)與光學切片能力： 這是突出的優勢。能清晰區分樣本中不同深度的結構，獲得樣本內部不同層面的清晰圖像，無需物理切片即可進行三維成像。
 

　　2.高對比度： 有效抑制離焦背景光干擾，顯著提高圖像的清晰度和信噪比，特別適合觀察厚樣本或弱熒光信號。
 

　　3.高分辨率： 相比傳統寬場熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡的X-Y平面分辨率也有一定提升(約1.4倍)，尤其在利用某些技術后分辨率可接近光學衍射極限。
 

　　4.三維重建： 可對活體或固定樣本進行非侵入性的三維結構解析。
 

　　5.多通道成像： 可同時或依次使用不同波長的激光激發不同的熒光標記物，實現多色標記樣本的多通道成像，研究不同分子或結構的共定位。
 

　　6.活細胞成像： 減少光毒性和光漂白(相對于寬場需要更短的曝光時間獲取清晰圖像)，結合合適的培養系統，可用于長時間觀察活細胞內的動態過程。
 

　　7.圖像后處理： 強大的軟件支持進行三維可視化、表面渲染、體積測量、共定位分析、熒光強度定量分析等。
 

　　四、主要應用領域
 

　　1.細胞生物學：
 

　　細胞器結構與動態(線粒體、內質網、高爾基體、細胞骨架)。
 

　　細胞膜結構與流動性。
 

　　細胞內離子濃度(如Ca²?, pH)成像。
 

　　基因表達與蛋白定位。
 

　　細胞間相互作用(如免疫突觸)。
 

　　細胞遷移與分裂。
 

　　2.神經科學：
 

　　神經元形態與樹突棘結構。
 

　　神經網絡連接。
 

　　突觸結構與功能。
 

　　神經遞質釋放與受體分布。
 

　　3.發育生物學： 胚胎發育過程的三維形態發生、基因表達模式。
 

　　4.病理學與臨床診斷：
 

　　組織病理學切片分析(提供比普通光鏡更豐富的亞細胞信息)。
 

　　皮膚科在體共聚焦顯微鏡用于無創診斷皮膚病(如黑色素瘤)。
 

　　5.免疫學： 免疫細胞激活、遷移、與靶細胞的相互作用。
 

　　6.微生物學： 細菌、真菌在宿主細胞內的生存、生物膜結構。
 

　　7.植物學： 植物細胞結構、細胞壁、葉綠體、基因表達。
 

　　8.材料科學： 材料表面形貌、涂層厚度、薄膜結構、微電子器件檢測、高分子材料結構等(常使用反射模式)。
 

　　五、關鍵注意事項與實踐??
 

　　??1.降低光毒性/光漂白：?? 這是活細胞成像的首要原則！
 

　　??最小激發強度：?? 使用??低有效??激光功率。
 

　　??最小有效曝光時間：?? 使用最快掃描速度或減少平均次數。僅在必要時才使用慢掃描和高平均。
 

　　??縮短總曝光時間：?? 避免在感興趣區域進行不必要的預掃描和尋找焦點操作。盡快找到位置聚焦完成拍攝。
 

　　使用盡可能低的增益。
 

　　使用高量子效率探測器，降低激發光需求。
 

　　使用抗淬滅試劑(僅限固定樣品，活樣品可能無效或有害)。
 

　　??2.針孔調整：??
 

　　并非針孔越小越好。過小的針孔會嚴重損失信號。
 

　　只有在需要最高分辨率或研究較薄樣品結構時，才考慮縮小針孔。
 

　　如果樣品很厚信號很弱或不需要超薄切片時，可以適當增大針孔以獲得足夠信噪比。
 

　　??3.選擇合適的物鏡：??
 

　　??數值孔徑(NA)是分辨率的關鍵！?? 優先選擇高NA物鏡。
 

　　浸沒介質選擇：油鏡分辨率最高，適用于蓋玻片固定的薄樣品；水鏡適用于活細胞長時間成像(避免折射率不匹配引起的球差)；硅油或甘油鏡適用于深組織成像。
 

　　放大倍數與視野、分辨率相匹配。
 

　　??4.實驗設計：??
 

　　選擇合適的熒光染料/蛋白，確保激發波長與激光匹配，發射波段范圍與檢測通道匹配。注意熒光串擾。
 

　　預實驗很重要：在不同條件下測試多種參數組合，找到最佳設置。
 

　　??5.儀器維護與安全：??
 

　　嚴格遵守激光安全規程：??絕對不要直視激光束！??
 

　　保持顯微鏡平臺穩定無震動。
 

　　保持環境清潔(灰塵是光學系統大敵)。
 

　　定期(按規程)由專業工程師進行系統校準(如激光準直、針孔校準、PMT校準)。